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實驗結果不理想?做好這幾點你就是ELISA大神

閱讀次數:47    發布時間:2024/1/9 10:23:21

Elisa實驗是一種敏感性高,特異性強,重復性好的實驗診斷方法。由于其試劑穩定、易保存,操作簡便,結果判斷較客觀等因素,已廣泛應用在免疫學檢驗的各領域中。ELISA檢測試劑盒適用于體外定性檢測人血清或血漿中的抗人類戊型肝炎(HEV)病毒 IgM 抗體ELISA檢測。ELISA法由于操作簡略,已被廣泛應用,今天咱們就來談談ELISA試劑盒需把握的關鍵有哪些?
 
1.在儲存及孵育過程中避免將試劑暴露在強光中。一切試劑瓶蓋須蓋緊以避免蒸發和污染,試劑避免受到微生物的污染,因為蛋白水解酶的干擾將導致呈現錯誤的結果。
    
2.小心汲取試劑并嚴格遵守給定的孵育時刻和溫度。請注意在汲取標本/規范品,酶結合物或底物時,第一個孔與最后一個孔加樣之間的時刻距離假如太大,將會導致不同的 “預孵育”時刻,然后明顯地影響到測量值的準確性及重復性。
    
3.試劑盒保存:部分試劑保存于-20℃,部分試劑保存于2-8℃,具體以標簽上的標示為準。
    
4.濃洗滌液會有鹽分出,稀釋時可在水浴中加溫助溶。
 
5.剛敞開的酶聯板孔中可能會含有少許水樣物質,此為正,F象,不會對試驗結果造成任何影響。

6.一切的樣品都應管理好,依照規則的程序處理樣品和檢測設備。

通常我們可用于ELISA檢測的樣本是有多種類型的,如血清、血漿、尿液、細胞培養上清或組織勻漿液等,不同類型的檢測樣本前期的處理方法是不一樣的。正確的處理樣本是保證ELISA檢測的正確性和準確性的第一步,下面簡單介紹一下細胞裂解液樣本及組織勻漿樣本的正確采集、處理方法。

細胞裂解液:

1.吸去培養板內的培養基,用胰酶消化細胞,加適量培養基將細胞從培養板上吹下來。懸浮細胞可省略。

2.收集細胞懸液,1000×g離心10min,棄去培養基,用預冷的PBS潤洗3次。

3.加入適量的預冷PBS或細胞裂解液(臨用前加入蛋白酶抑制劑)重懸細胞。通常6孔板一個孔的細胞量需要150~250μL PBS重懸。

4.將樣品放入-20℃或-80℃,使樣品冷凍,再放室溫解凍樣品,反復凍融幾次,使細胞充分裂解。也可將樣品進行超聲破碎,以達到裂解的目的。

5.4℃10000×g 離心10min,除去細胞碎片,取上清,-20℃或-80℃保存,避免反復凍融。

組織勻漿液:

1.將組織樣本用PBS (0.01M, PH 7.4) 沖洗,洗去組織表面殘留的血液或雜質。

2.將組織塊稱重,記錄后剪碎,碎塊應盡量小,便于勻漿得更充分。

3.將組織按一定的比例加入預冷的PBS(臨用前加入蛋白酶抑制劑)勻漿,勻漿時置于冰上或冰浴中。(通常按組織重量:PBS體積=1:9的比例勻漿,例如1g的組織樣本對應9mL的PBS,具體體積可根據實驗需要適當調整,檢測后計算樣品濃度時應乘以相應的稀釋倍數)。

4.吸取勻漿液到離心管,4℃5000×g 離心5~10min,取上清,-20℃或-80℃保存,避免反復凍融。

注意:保證樣本不含NaN3,因為NaN3會抑制HRP的活性,從而導致假陰性的結果。

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