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WB實驗:膜上一片空白怎么回事?

閱讀次數:62    發布時間:2024/1/2 10:05:59

    恒遠生物主要經營科研試劑產品,現擁有各物種基因產品50余萬種;重組蛋白20余萬種;數十個種屬的多克隆抗體3萬多種和高質量單克隆抗體數百種。恒遠品牌自主研發ELISA試劑盒,現已涵蓋20多個種屬,數千種產品,涉及腫瘤、激素、自身免疫、心血管、代謝等十多個研究領域。本周小編給大家帶來的是:WB實驗結果——膜上一片空白,到底是什么原因導致的呢?一起來看看吧!


    一、膠和膜放反了:如果在轉印的過程中,膠和膜的位置顛倒了,那么蛋白就從膠上轉移到緩沖液中,而不會到達膜上。對于標準的轉印,凝膠應靠近三明治的負極,而膜對應正極。

    二、轉膜效率低:轉膜效率受多種因素影響,包括蛋白的大小、凝膠中丙烯酰胺的百分比、電場強度、轉印時間和緩沖液的PH值。一般來說,蛋白越大,轉移的越慢。轉移大蛋白最好的方法是用高的電場強度。而小蛋白長時間處于高電場強度下可能會傳出轉印膜。避免這個問題的方法是用0.2μm孔徑的PVDF膜進行轉印。如果蛋白的等電點接近緩沖液的pH值,那么這個蛋白攜帶的電荷很少,在電場中頁幾乎不移動。如果你的目的蛋白是強堿性的,那么你可以用碳酸鹽(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性緩沖液。

    三、試劑放置太久或存放條件不正確:抗體會慢慢降解,如果反復凍融的話,它會快速降解。底物應儲存在-20℃。

    四、抗體不純或滴度太低:一抗的濃度差異很大,應該根據經驗來決定一抗的稀釋度。一般的原則是以1:100-1:1000來稀釋血清或組織培養上清,以1:1000-1:10000來稀釋腹水或超免疫動物的血清。Bio-Rad的印跡級別的二抗稀釋度是1:3000。

    五、酶失活了:疊氮鈉是辣根過氧化物酶的抑制劑。不要再HRP顯色的western blot中使用任何含疊氮鈉的試劑。疊氮鈉可以用于堿性磷酸酶結合的抗體中,而無副作用。另外,只能使用蒸餾的去離子水。

    六、使用Tween-20洗滌:Tween-20(吐溫-20)可能會干擾某些抗體-抗體相互作用,或洗去PVDF膜上的目的蛋白。因此除了封閉之后的第一次洗滌,其他洗滌過程中都不使用Tween-20。

    七、檢測系統缺乏足夠的靈敏度:確保蛋白的上樣量在檢測系統的靈敏度范圍內。

    更多實驗資訊可咨詢我司業務員。上海恒遠生物科技有限公司擁有自己的實驗室,備有專業的技術研發團隊,長期致力于各種生物試劑,細胞,血清,ELISA試劑盒的研發與銷售,實驗提供免費代測服務,并提供精湛的技術服務,如果您有實驗上的問題歡迎前來咨詢,為您提供專業的一對一技術指導。

原創作者:上海恒遠生物科技有限公司

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