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解決方案

輕松掌握細胞凋亡檢測實驗的方法

閱讀次數:37    發布時間:2024/1/19 9:47:12

細胞凋亡是一種細胞主動有序的死亡,它涉及一系列基因的激活、表達以及調控等作用,它并不是病理條件下自體損傷的一種現象,而是為了更好地適應生存環境而主動爭取的一種死亡。本期恒遠生物給大家介紹細胞凋亡檢測實驗的方法,一起來學習下吧!


一、PI 單染色法
1. 收集細胞{數目約(1~ 5)×106 個/mL},500 ~ 1000 r/min 離心 5min,棄去培養液。
2. 3ml PBS 洗滌 1 次。
3. 離心去 PBS,加入冰預冷的 70%的乙醇固定,4℃,1—2 小時。
4. 離心棄去固定液,3mlPBS 重懸 5min。
5. 400 目的篩網過濾 1 次,500—1000r/min 離心 5min,棄去 PBS。
6. 用 1ml PI 染液染色,4℃避光 30min。
7. 流式細胞儀檢測:PI 用氬離子激發熒光,激光光波波長為 488nm,發射光波波長大于630nm,產生紅色熒光分析 PI 熒光強度的直方圖也可分析前散射光對側散射光的散點圖。
8. 結果判斷:在前散射光對側散射光的散點圖或地形圖上,凋亡細胞與正常細胞相比,前散射光降低,而側散射光可高可低,與細胞的類型有關;在分析 PI 熒光的直方圖時,先用門技術排除成雙或聚集的細胞以及發微弱熒光的細胞碎片,在 PI 熒光的直方圖上,凋亡細胞在G1/G0 期前出現一亞二倍體峰。如以 G1/G0 期所在位置的熒光強度為 1.0,則一個典型的凋亡細胞樣本其亞二倍體峰的熒光強度為 0.45,可用雞和鮭魚的紅細胞的 PI 熒光強度做參照標準,兩者分別為 0.35 和 0.7,可以確保在兩者之間的不是細胞碎片而是完整的細胞。

注意事項:
細胞凋亡時,其 DNA 可染性降低被認為是凋亡細胞的標志之一,但這種 DNA 可染性降低也可能是因為 DNA 含量的降低,或者是因為 DNA 結構的改變使其與染料結合的能力發生改變所致。在分析結果時應該注意。

二、Annexin V/PI 雙染色法

1. 細胞收集:懸浮細胞直接收集到 10ml 的離心管中,每樣本細胞數為(1~5)×106,/mL 500~1000r/min 離心 5min,棄去培養液。
2. 用孵育緩沖液洗滌 1 次,500~1000r/min 離心 5min。
3. 用 100ul 的標記溶液重懸細胞,室溫下避光孵育 10~15min。
4. 500~1000r/min 離心 5min 沉淀細胞孵育緩沖液洗 1 次。
5. 加入熒光(SA-FLOUS)溶液 4℃下孵育 20min,避光并不時振動。
6. 流式細胞儀分析:流式細胞儀激發光波長用 488nm,用一波長為 515nm 的通帶濾器檢測 FITC 熒光,另一波長大于 560nm 的濾器檢測 PI。
7. 結果判斷:凋亡細胞對所有用于細胞活性鑒定的染料如 PI 有抗染性,壞死細胞則不能。

總結:細胞膜有損傷的細胞的 DNA 可被 PI 著染產生紅色熒光,而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產生。因此,在細胞凋亡的早期 PI 不會著染而沒有紅色熒光信號。正;罴毎c此相似。在雙變量流式細胞儀的散點圖上,左下象限顯示活細胞,為(FITC-/PI-);右上象限是非活細胞,即壞死細胞,為(FITC+/PI+);而右下象限為凋亡細胞,顯現(FITC+/PI- )

三、Heochst 33342/PI 雙染色法

1. 懸浮生長的細胞在培養的狀態下加入 Heochst 33342 ,終濃度為 1ug/ml; 37℃孵育7—10min。
2. 低溫 500 ~ 1000r/min 離心 5min 棄去染液。
3. 加入 1.0ml PI 染液,4℃避光染色 15min。
4. 400 目的篩網過濾 1 次。
5. 流式細胞儀分析:Heochst 33342 用氪激光激發的紫外線熒光,激發光波波長為352nm,發射光波波長為 400 ~ 500nm,產生蘭色熒光;PI 用氬離子激光激發熒光,激發光波波長為 488nm,發射光波波長大于 630nm,產生紅色熒光。分析蘭色熒光對紅色熒光的散點圖或地形圖。
6. 結果判斷:在蘭色熒光對紅色熒光的散點圖上,結果為:正常細胞為低藍光/低紅光,凋亡細胞為高藍光/低紅光,壞死細胞為低藍光/高紅光。 

注意事項:
① 在紅色熒光對蘭色熒光散點圖上,還可見到細胞凋亡區向細胞壞死區遷移的軌跡,可能是凋亡細胞的 DNA 進一步降解的緣故。
② 用 Heochst 33342 染料與細胞孵育的時間不宜過長,一般控制在 20min 之內為宜。如果太長可引起 Heochst 33342 的發射光譜由藍光向紅光的遷移,導致紅色熒光與蘭色熒光的比例改變,從而影響結果的判斷。

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